高光学纯L-草铵膦生物制造的创新与发展

草铵膦是全球三大除草剂之一，具有广谱、活性高、非选择性等特点，市场前景被广泛看好。然而，草铵膦具有两种对映异构体（D型和L型），其除草活性主要来自于其中的L型对映体（L-草铵膦）。因此，高光学纯L-草铵膦高效合成至关重要。

草铵膦（英文名glufosinate或phosphinothricin；简称PPT）是一种氨基酸类除草剂，其历史可以追溯到1972年德国科学家从链霉菌发酵液中分离得到了一种具有除草活性的三肽化合物——双丙氨膦。他们对其结构鉴定，发现该三肽是由两分子L-丙氨酸以及一种当时还未知的氨基酸构成。

而后，赫斯特公司采用化学法合成了这种未知氨基酸，并命名为草铵膦；同时，发现这种天然氨基酸具有非常好的除草活性。其原理是草铵膦在分子结构上与谷氨酸非常相似，故草铵膦与谷氨酰胺合成酶的活性位点可发生可逆结合，抑制了谷氨酰胺合成途径，导致植物体内氮代谢紊乱造成铵过量积累、叶绿体解体，从而使光合作用受抑制，最终导致植物死亡。

近年来，随着耐草铵膦转基因作物新品种的开发与推广，加上草甘膦抗性杂草的增加及百草枯的禁用（百草枯对人体毒性极大，且无特效解毒药）。草铵膦作为一种广谱、高效的非选择性除草剂获得了巨大的发展空间，2022年其市场规模超10亿美元，已成为全球第二大除草剂、用量最大的手性除草剂。随着新生代转基因的渗透、百草枯的禁用替代和复配制剂的增加，草铵膦需求量不断增加，其制造技术也不断发展，下面就D，L-草铵膦的主流生产工艺进行总结与分析。

D，L-草铵膦生产工艺壁垒较高，目前全球主要有三条草铵膦产业化生产路线：即热裂解-ACA工艺（简称″气相合成″）、铝法-Strecker工艺（简称″铝法合成″）、格氏-Strecker工艺（简称″格氏合成″）。但普遍面临反应条件要求高、工艺复杂、过程控制难度大、成本较高等问题，目前国内仅少数公司能实现规模化稳定生产。三种工艺方法在合成方法原理上有其相似之处，但在原材料成本、过程损耗、环保友好性和收率等方面区别较大。

国内外许多研究团队都对该路线进行了深入研究，浙江工业大学是国内较早开展MDP化学合成研究的科研院校，采用氯甲烷为甲基供体合成MDP，转化率达81.3％。产业化方面，热裂解-ACA工艺由德国公司率先研发成功并实现了连续化生产，具有自动化程度高，反应过程中无溶剂、无气味，几乎无渣排放，胺化和水解后的水相都可以蒸发回收、套用等优点。整个工艺中最关键的核心技术和难点是中间体MDP的制备，这也是合成含磷农药的重要中间体。以气相连续法合成MDP技术壁垒最高，虽然该工艺已过了专利保护期，但因工艺标准要求极高（需要在600℃以上高温下气化裂解来制备MDP、高温反应时会产生固体沉积物吸附在反应器壁上等），国内仅极少数企业能够运用该工艺进行D，L-草铵膦的量产。

草铵膦以外消旋体形式上市以来，多国科学家在实验室水平研究其不同对映体的功效和毒性，发现D-草铵膦、L-草铵膦的除草能力差别巨大。笔者研究团队经过20多年研究，开发成功″高纯生物精草″，在中国生物农药之父沈寅初院士的指导下，建立了基于酰胺酶、脱乙酰基酶、氨基酸氧化酶、脱氢酶、还原胺化酶、酮酸转氨酶、腈水合酶、腈水解酶等生物催化技术以及从头合成的合成生物学技术制备L-草铵膦路线，成为当前有关L-草铵膦研发获得发明专利授权和学术论文发表最多的单位。2016年，浙江工业大学联合国内多家企业，利用生物法合成的高纯L-草铵膦、D-草铵膦，在海南省进行田间除草对比试验，在大田试验水平证明：1倍当量L-草铵膦能够达到2倍当量D，L-草铵膦用量的除草效果。这些研究为L-草铵膦的应用奠定了基础，揭示其良好的市场前景。因此，L-草铵膦的推广能够降低50%施药量，全球每年可直接减排数万吨的无效体（低效体）D-草铵膦，有效减轻农田耕作过程中无效化学物质的使用及对环境造成的负担，符合国家农药减量增效政策。

各国农药制造企业尝试开发了外消旋体拆分法、不对称合成法、天然氨基酸手性源法、手性辅助剂诱导等方法化学合成L-草铵膦，但由于立体选择性低、产物收率低、生产成本高等因素，始终没能进行大规模生产。例如，日本明治制果公司利用不对称Strecker反应、经酸性水解转化得到含氯离子的L-草铵膦，主要用于高档瓜果、花卉等经济作物的除草，改进L-草铵膦的化学合成，但由于产品生产成本高，含氯易引起土壤板结，很难大规模推广应用。

生物法合成L-草铵膦具有反应条件温和、立体选择性高等优点。笔者研究团队经过20多年的研究，与多家企业合作，开发了以下五大工艺路线与技术。路线1：混旋体衍生化-拆分路线；路线2：利用外消旋D，L-草铵膦为底物的混旋体合成-去消旋化路线；路线3：通用化合物氰基化再水解路线；路线4：从常用化学品合成L-草铵膦路线；路线5：从头合成高丝氨酸再化学合成L-草铵膦。下面就这些工艺路线进行详细分析。

通过L-草铵膦的生物合成创新，结合笔者研究团队已完成的腈水解酶介导的R-扁桃酸和加巴喷丁的生物制造产业化工作。笔者研究团队阐明了选择性工业腈水解酶科学发现的方法学原理，发现了一系列高效选择性腈水解酶，建立了国际上种类最多的选择性腈水解酶工业酶库和菌种库。阐明了选择性腈水解酶理性设计的分子基础，通过创新腈水解酶″人工合成底物口袋结构重塑″等分子设计新方法，进化出迄今为止工业属性最强的选择性腈水解酶，服务于腈化合物的选择性水解。

2.6 L-草铵膦生产技术比较

总体来说，L-草铵膦合成路线较多，技术含量高（表2）。所涉及到的酶很多，有腈水解酶、酰化酶、氧化酶、脱氢酶、转氨酶等等，涵盖5大酶系；关键的胺化过程可以分为生物有机胺化和生物无机胺化，前者需要过量的有机胺，不利于分离纯化，而后者利用无机铵，具有很好的工业属性；再次，不同路线对应的底物不同，这对化学合成模块与生物合成模块的对接提出了很高的要求。

如果设计生物氧化还原反应合成L-草铵膦，则需要在反应体系中增加还原型辅酶NADH或NADPH提供还原力。考虑到成本问题，工业上不可能在反应体系中添加等化学计量的NAD（P）H，构建高效的辅酶循环系统来替代辅酶的大量添加，是很好的解决途径。在酶法、光化学法、电化学法和化学法等四种方法中，酶法具有效率高、环境友好、选择性高等特点，被广泛应用于生物制造过程中辅酶NADH/NADPH的再生。主要有三种酶，即葡萄糖脱氢酶（GDH）、甲酸脱氢酶（FDH）和醇脱氢酶（ADH），基于这三种酶的辅酶循环系统特点总结于表3。葡萄糖脱氢酶是一种短链脱氢酶，为同源四聚体，存在于细菌和古细菌中，其优势在于其底物葡萄糖价格低廉，且该酶催化效率高，对NAD+和NADP+均有活力；葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统在催化过程中不断将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，致使体系的pH下降，故需在反应过程中调节pH；其次，要获得高纯度的L-草铵膦原药，需要去除用GDH引入的副产物葡萄糖酸，需要进一步进行分离纯化。FDH主要来源于细菌、酵母与植物，其优势在于其能够利用无毒害的甲酸作为NADH再生的氢供体，且甲酸盐的氧化反应不可逆，副产物CO2具挥发性，很容易从生物反应体系排出，避免后续副产物的分离。甲酸脱氢酶辅酶再生系统的主要限制因素是其催化性能较低（大多数天然FDH的kcat/Km−1s−1）、底物亲和力较差（Km>10mM）、对于NADP+的特异性差（（kcat/Km）NADP+/（kcat/Km）NAD+，通常低于30），因而应用受到限制。笔者研究团队通过解析甲酸脱氢酶辅酶选择性、酶活、稳定性机制，利用″祖先序列重构″、″多性能协同进化″等手段，创制了高选择性、高酶活、高稳定性的甲酸脱氢酶，克服了″鱼和熊掌不可兼得″的″trade-off″效应，建立了适合高光学纯L-草铵膦等手性氨基酸合成的生物催化体系。ADH能够可逆地催化醛和酮选择性还原为伯醇和仲醇，主要应用于酮类的不对称还原，但氧化反应也有报道。醇脱氢酶通常将异丙醇作为辅酶再生的底物，将其氧化为丙酮，同时将NAD（P）+还原为NAD（P）H。其优势在于其底物异丙醇经济易得，且副产物丙酮沸点低，易于除去；但由于反应可逆，需添加过量的底物来促进反应进行，高浓度的有机溶剂虽然一定程度上可以助溶，但却可能抑制反应体系中其他酶类的活性。

从上述分析中，我们可以发现L-草铵膦的生物制造涉及的反应类型有腈化、水解、脱胺、转胺、加成、缩合、拆分、氧化、还原、取代；生物催化剂有耐CN腈水解酶、水合酶、酰胺酶、酰化酶、脱乙酰基酶、氨基酸氧化酶、草铵膦脱氢酶、还原胺化酶、酮酸转氨酶、腈水合酶等多品种酶的级联和耦合；而工业化装备更是包括高密度生物发酵罐、陶瓷膜、氧气循环反应装置、酶膜反应器；连续流微通道反应器、连续流管式反应器、连续流釜式反应器等等，是一个综合创新的集中体现。进一步，因为草铵膦的需求量大，无论采用生物酶/细胞催化还是发酵介导的L-草铵膦生物制造方式都需要进行吨级发酵。笔者研究团队通过发酵模式和诱导方式的创新，增加单细胞内多酶可溶性表达量；提出了pH恒定补料反馈补料发酵策略，过程更具成本和环保优势；在5吨、50吨发酵罐上实现多基因共表达工程菌的规模化发酵生产，催化剂单位体积酶活和L-高丝氨酸的糖酸转化率均达到文献报道最高水平。

D，L-草铵膦作为外消体已经上市近30年，随着百草枯的禁用和耐草铵膦转基因作物的推广，其市场前景被不断看好。根据实验室和大田试验的结果表明：绝大部分除草活力来自于L-草铵膦，而D-草铵膦基本没有除草活性，是一种环境负担物质。随着草铵膦用量的增加，每年可能会有几万吨的D-草铵膦污染。因此，发展L-草铵膦替代D，L-草铵膦对我国农药实现增效减量将起到极大的推动作用。而生物制造技术以其特有的高立体选择性、反应条件温和等特点，吸引了众多科技工作者开发L-草铵膦生物制造技术。目前已形成多种工艺路线，其中，利用外消旋D，L-草铵膦为底物的混旋体合成-去消旋化路线适用于已掌握了″气相合成″D，L-草铵膦的企业，成本低，三废排放少，产品对土壤友好，具有很强的市场竞争力；而从头合成L-草铵膦则比较适合于合成生物相关企业。因此，笔者认为这四条路线在不同类型企业会展示出不同的潜力，真正实现大规模工业化后，究竟那条路线的成本和环保优势最明显，需要充分考虑底物/中间体合成成本、底物/中间体和辅底物的回收利用、酶活力和立体选择性、产物分离纯化、副产物的回收利用、生产线的数字智能化控制水平等方面的综合因素。

来源：《合成生物学》