腐植酸最高产量近357mg/g，重庆大学团队确定最佳发酵参数

化肥被视为粮食的“粮食”，其在增加土壤肥力、提高农作物产量等方面发挥着重要作用。然而，不当或者过度使用化肥会造成严重的环境污染，害虫抗药性增强以及食品安全性下降。

因此，开发绿色、可持续的生物肥料受到重视和关注。堆肥是一种生产有机肥的过程，可以将秸秆等农业废弃物更环保和更可靠地循环利用起来，其生产的有机肥料具有较高的腐植酸（HA）含量和丰富的微生物。腐植酸是一种天然有机高分子化合物，也是腐殖质的主要组成部分。

虽然，领域内已经对堆肥过程中微生物如何将木质纤维素转化为生物肥料进行了一定的研究，但是对微生物群落与腐植酸生物合成之间关系的研究还缺乏详细的探讨。

为了深入回答这一问题，来自重庆大学的研究人员分别研究了堆肥过程中接种量、底物粒径和通风量（aeration rate）等条件对腐植酸生物合成的影响，并通过高通量测序分析了堆肥不同阶段腐植酸生物合成与微生物群落和代谢功能之间的关系。相关研究已发表在Applied Microbiology and Biotechnology上。

在研究中，科研团队确定了生物合成腐植酸的最佳反应条件，并在此条件下获得了腐植酸的最高产量，约为 356.9 g/kg（356.9 mg/g）。研究团队指出，这项工作可能有助于探索新的调控策略，从而提高农业废弃物转化为生物肥料的效率。

（来源：Applied Microbiology and Biotechnology）

本文的通讯作者是重庆大学生物工程学院教授王永忠，他长期开展细胞工厂构建、微生物代谢与调控以及生物传感与检测等研究。

在本试验中，研究人员以稻草为堆肥底物，分别研究了接种量、底物粒径和通风量对生物合成腐植酸的影响，并通过试验确定最佳反应条件。

该团队首先测试了接种量的比例，接种比例设置为 5%、10%、15%、20% 和 25%（v/v），初始底物粒径为 0.38 mm，通风量为 0.5 L/kg DM/m，分别绘制了不同接种量下的总有机碳（TOC）、总氮（TN）、腐植酸产量和木质纤维素降解率。试验结果显示，总有机碳在堆肥初期 0-16 天略有下降，在第 16 天-22 天急剧下降。这说明嗜热微生物在堆肥初期代谢活性较弱，适应发酵环境后代谢活性显著增强。

在堆肥过程中，总氮含量稳定增加，这表明堆肥可以有效促进稻草等含氮有机基质的降解；堆肥结束时，接种量为 20% 时总氮含量最高，达到了 1.50%。研究人员进一步发现接种量为 20% 时堆肥的成熟度最高，且腐植酸产量在接种量为 20% 时达到峰值，产量为 351.72 mg/g ，这表明接种量为 20% 可以达到较高的腐殖化水平；此外，研究人员还发现，接种量为 15% 和 20% 的试验组中木质素、纤维素和半纤维素的降解率均显着高于其他组。这表明，适当的接种量会促进有机化合物快速分解合成腐植酸。

▲图 | 接种量对堆肥过程中总有机碳、总氮、腐植酸产量和木质纤维素降解率的影响（来源：上述论文）

然后，该团队在通风量为 0.5L/kg DM/m、接种量为 20% 以及室温条件下研究了不同底物粒径 4.75 mm、2.36 mm、0.83 mm、0.38 mm 和 0.25 mm 对腐植酸发酵的影响。试验结果显示，基质粒径为 0.83 mm 的稻草堆肥中微生物分解了更多的有机物。这表明，底物粒径为0.83 mm时，秸秆的比表面积有利于堆肥中 O₂ 的质量传递和微生物细胞在基质表面的吸附；当底物粒径为 0.83 mm 时，总氮含量达到最大即 1.51%，这表明适当的底物粒径在堆肥过程中促进含氮化合物的稳定降解且使用粒径 0.83 mm 的底物可以达到最高成熟度。

试验结果进一步显示，当底物粒径为 0.83 mm时，腐植酸产量最高，为 302.59 mg/g；发酵结束时，研究人员还观察到底物粒径为 0.83 mm时，纤维素降解率达到了最高值 54.43%，表明大部分纤维素可以被微生物水解。“上述结果表明，合适的底物粒径有利于 O₂ 的质量传递、细胞吸附和底物的降解，从而使得堆肥过程中微生物群落结构发生变化。”

接下来，该团队测试了通风量对生物合成腐植酸的影响，发现当通风量为 0.3 L/kg DM/m 时在总有机碳、总氮、腐植酸产量和木质纤维素降解率方面的表现最佳，且纤维素达到了最大降解率 61.38％。

因此，研究人员确定了生物合成腐植酸的最佳发酵参数：接种量=20%，基质粒径=0.83 mm 以及通风量=0.3 L/kg DM/m。在此条件下，腐植酸的产量达到了峰值 356.9 mg/g。

完成上述试验后，该团队尝试系统阐明堆肥过程中微生物群落结构的变化，对第 0 天（M01）、第 10 天（M02）、第 22 天（M03）和第 36 天（M04）样品以及生物合成腐植酸的最佳操作参数进行了高通量测序。样品中，M04 的微生物丰度最高，而 M01 的微生物多样性最低；然后分析参与腐植酸生物合成的功能微生物，确定了变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门是影响堆肥腐殖化过程的优势门等以及堆肥过程中的优势属。这些工作表明了优势菌属能够对堆肥过程中的腐殖化作用产生有效影响。

▲图 | 稻草堆肥过程中微生物群落的门级（a）和属级（b）（来源：上述论文）

随后，对细菌群落代谢功能谱的分析，进一步表明这些碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能基因参与木质纤维素生物降解和腐植酸的生物合成。

“我们的研究结果能够为阐明稻草堆肥中优势属的潜在功能和腐植酸的生物合成机制提供见解。”